Metode Isolasi Plasmid dengan Metode Alkaline Lysis

No comment 1694 views

Metode Isolasi Plasmid dengan Metode Alkaline Lysis : Langkah dan Prinsip Isolasi Plasmid Bakteri

Kultur dan Pemanenan Sel Bakteri Untuk Isolasi DNA Plasmid

Untuk mengisolasi plasmid bakteri, tentu saja Anda harus mengkulturkan bakteri tersebut pada bakteri yang mengandung nutrisi tinggi, umumnya medium yang digunakan adalah medium Luria Bertani (LB).

Pada buku Molecular Genetics yang ditulis oleh Sambrook dkk, 1 buah koloni tunggal bakteri ditumbuhkan pada medium LB (dengan volume 2-10 mL) dan diinkubasi pada shaker inkubator (150 rpm) suhu 37ºC semalaman.

Hal yang harus Anda perhatikan adalah kepadatan pertumbuhan dan usia dari bakteri Anda.

Usia bakteri mempengaruhi rigiditas dinding sel dan keberhasilan proses lisis sel. Oleh karena itu, usia kultur terbaik untuk mengisolasi plasmid dari bakteri adalah semalam (kultur overnight). Diasumsikan, kultur overnight berisi sel-sel bakteri yang ‘muda’.

Kepadatan jumlah sel bakteri pada kultur menentukan jumlah DNA plasmid yang Anda peroleh dari proses isolasi plasmid lisis alkali ini. Terutama jika plasmid yang Anda inginkan adalah plasmid yang memiliki copy number rendah.

Oleh karena itu, digunakan medium yang kaya nutrisi dan proses penggoyangan yang cepat agar sel-sel mendapat suplai nutrisi yang merata hingga pertumbuhannya baik dan padat.

Pemanenan Sel Untuk Mengisolasi Plasmid

Sel dipanen dengan menggunakan metode sentrifugasi pada kecepatan maksimum dari microfuge yang Anda miliki (10000rpm) selama 1 menit pada suhu 4ºC. Buang seluruh supernatant dengan perlahan. Anda dapat membuang tetesan dan sisa supernatant dengan memipetnya dengan perlahan.

Proses ini dapat diulang sebanyak 2 kali jika pelet yang didapat kurang banyak.

Umumnya bakteri memiliki komponen yang dapat menghambat kinerja enzim endonuklease, oleh karena itu, jika Anda ingin mendigesti plasmid anda dengan enzim restriksi, Anda harus mencuci pelet sel yang didapat dengan larutan Sucrose Tris-EDTA (STE buffer).

Anda dapat menambahkan 1 mL STE buffer yang telah didinginkan pada pelet dan disuspensi dengan memipetnya perlahan-lahan hingga seluruh pelet teresuspensi.

Setelah itu, sentrifugasi suspensi sel tersebut pada kecepatan maksimum dari microfuge yang Anda miliki (± 10000rpm) selama 1 menit pada suhu 4ºC. Buang seluruh supernatant dengan perlahan, Anda bisa menggunakan pipet untuk membuang genangan supernatant diatas pelet yang masih tersisa.

Tahapan Isolasi Plasmid dengan Metode Lisis Alkali (Alkaline Lysis)

Metode isolasi DNA plasmid ini terdiri dari tiga tahapan utama. Tahapan tersebut antara lain resuspensi pellet sel dengan buffer glucose Tris-Cl EDTA (GTE), lisis dengan larutan lisis SDS 1% dalam NaOH yang dinetralkan dengan larutan penetral potasium asetat, dan diakhiri dengan pemanenan DNA plasmid menggunakan presipitasi etanol.

Bacaan lanjutan  Rekayasa Genetika Pada Escherichia coli Untuk Produksi Protein Benang Laba-laba

Karena bahan-bahan yang digunakan berbahaya, Kami sarankan Anda menggunakan sarung tangan karet, jas lab, dan kacamata pelindung saat mengerjakan prosedur-prosedur isolasi DNA plasmid ini.

Langkah dan rincian tiga tahapan utama tersebut adalah sebagai berikut:

Resuspensi dan Pengikatan Ion Mg2+ dan Ca2+

Resuspensi dilakukan dengan menambahkan 100 μL GTE (solution I/ larutan A) dingin pada pelet hasil proses pencucian dan dicampur dengan bantuan pipetting selama beberapa kali hingga seluruh pelet teresuspensi. Jika perlu, gunakan Vortex untuk memastikan sel telah merata.

Fungsi dari masing-masing komponen buffer GTE adalah sebagai berikut:

 

  • Glukosa sebagai penjaga tekanan osmotik hingga sel tidak ‘meledak’ dan ‘menyemburkan’ DNA genom yang tidak diinginkan
  • Tris-Cl menjaga agar pH larutan tetap 8.0
  • EDTA merupakan agen pengkhelat yang dapat mengikat ion Mg2+ dan Ca2+. Kedua ion tersebut dibutuhkan untuk menjaga rigiditas dinding sel dan kinerja dari DNAse yang akan merusak hasil isolasi DNA plasmid

Lisis Alkali Untuk Mendapatkan Plasmid

Sel dilisis dengan menambahkan 200 μLlarutan lisis alkali (larutan B/solution II) yang dibuat dari NaOH 0,1 hingga 0,2 N yang telah dicampur 1% (b/v) SDS. Campuran dibolak-balik (di-invert) perlahan sebanyak 10x.

Perhatikan! Pastikan larutan B ini segar dan dibuat saat Anda akan memulai ekstraksi plasmid.

Setelah itu, tambahkan 150 μL solution III (larutan C) dingin yang terdiri dari asam asetat glasial dan potasium asetat. Campuran diinvert perlahan beberapa kali sebelum didiamkan selama 3-5 menit on ice.

 

Fungsi masing-masing komponen dari larutan ini adalah:

  • SDS akan melarutkan membran sel bakteri hingga sel perlahan lisis dan ‘meledak’. SDS juga berfungsi merusak protein dan pengotor lain.
  • NaOH juga merusak membran sel bakteri. Namun peranan utama dari NaOH adalah merusak ikatan hidrogen dsDNA hingga molekul utas ganda tersebut memisah menjadi dua utas ssDNA.
  • Potasium asetat berfungsi sebagai penurun pH hingga ssDNA dapat kembali menjadi dsDNA. Namun, dengan waktu inkubasi yang singkat, DNA plasmid akan menyatu lebih cepat dibandingkan DNA genom yang panjang.
Bacaan lanjutan  Variasi Analisis Dalam Mengungkap Sistematika Bakteri

DNA plasmid yang didapat dipanen dengan metode sentrifugasi pada kecepatan maksimum dari microfuge yang Anda miliki (± 10000rpm) selama 4 menit pada suhu 4ºC. Transfer supernatant pada microtube baru.

Komponen sel yang berukuran besar seperti organel dan DNA genom akan mengendap (pelet) bersama SDS yang mengikat DNA genom dengan interaksi hidrofobik, sedangkan DNA plasmid yang cenderung ringan dan tidak terikat SDS akan tetap terlarut pada supernatant.

Pembersihan Senyawa Pengotor dengan Kloroform dan Fenol

DNA plasmid yang dihasilkan dari prosedur lisis alkali diatas masih mengandung banyak pengotor seperti garam-garam, komponen sel, dan protein-protein. Oleh karena itu, dilakukanlah pembersihan dengan menggunakan kloroform dan fenol.

Fenol akan mendegradasi protein-protein dan komponen sel yang masih tersisa. Sedangkan kloroform akan mengikat fenol beserta protein dan komponen sel terdegrasasi hingga terpisah dari plasmid yang diinginkan.

Langkah pembersihan ini dilakukan dengan langkah berikut

  • Pada tube berisi supernatant, ditambahkan campuran 1:1 fenol dan kloroform sejumlah volume supernatant yang didapat.
  • Anda dapat menggunakan kloroform jika tidak memiliki fenol.
  • Campuran tersebut divortex secara perlahan beberapa detik dan disentrifus pada kecepatan maksimal selama 2 menit dalam suhu 4ºC.
  • Transfer lapisan terlarut air pada bagian atas kedalam microtube baru. Usahakan hindari lapisan non-polar pada bagian tengah dan bawah dari lapisan atas yang mengandung debris sel dan komponen lain yang tidak diinginkan

Presipitasi DNA Plasmid dengan Ethanol

DNA tidak terlarut dalam pelarut non-polar sepeti etanol dan isopropanol. Oleh karena itu, DNA akan mengendap saat ethanol atau isopropanol ditambahkan kedalam campuran ekstraksi plasmid.

DNA plasmid dalam supernatant diendapkan menggunakan ethanol absolut sebanyak dua kali volume supernatant yang didapat dari tahap pembersihan DNA plasmid menggunakan fenol:kloroform.

Misalnya begini,

Jika supernatant yang didapat memiliki volume ± 150 μL, maka jumlah ethanol absolut yang ditambah juga sebanyak 300 μL. Jika Anda tidak memiliki ethanol absolut, Anda bisa menggunakan isopropanol.

  • Setelah di-invert hingga nampak merata, diamkan microtube berisi campuran dalam freezer atau on ice selama 30 menit.
  • Setelah 30 menit, campuran disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan maksimal dan suhu 4ºC. Supernatan dibuang perlahan. DNA yang terpresipitasi dapat ditemukan dalam bentuk pelet putih yang sangat tipis.
  • Setelah menghilangkan seluruh ethanol, tambahkan 1 mL ethanol 70% pada microtube berisi pelet DNA plasmid dan diinvert beberapa kali hingga merata
  • Campuran disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan maksimal dan suhu 4ºC. Supernatan dibuang perlahan. DNA yang terpresipitasi dapat ditemukan dalam bentuk pelet putih yang sangat tipis.
  • Tambahkan 50 μL.buffer TE yang telah ditambahkan RNAse A dan simpan pada suhu 4ºC
  • Anda dapat melakukan pengukuran dengan nanodrop atau melihat ukuran basa yang didapat dengan menggunakan elektroforesis

 

Incoming search terms:

  • Buffer lisis bakteri
  • fungsi potasium asetat dalam isolasi dna
  • Fungsi laruran lisis
  • membuat isolasi dna plasmid
author
Author: 
Laila Karomah yang lebih sering berpetualang di dunia maya sebagai evilgenius, merupakan mahasiswi Mikrobiologi Institut Pertanian Bogor. Bidang yang digemari oleh pegiat IT otodidak ini adalah mikrobiologi kesehatan, mikrobiologi lingkungan, bioteknologi mikrob, dan enzimologi.

Leave a reply "Metode Isolasi Plasmid dengan Metode Alkaline Lysis"

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.