Estimasi Aktivitas Penambatan Nitrogen Biologis (Aktivitas Enzim Nitrogenase)

Menguji aktivitas penambatan nitrogen biologis adalah usaha untuk mengetahui jumlah gas nitrogen (N2), yang diikat oleh suatu mikroorganisme atau tumbuhan yang bersimbiosis dengan mikroorganisme penambat nitrogen. Uji ini dilakukan untuk mengetahui mikroorganisme penambat nitrogen potensial maupun untuk mengetahui apakah laju penambatan nitrogen berubah dengan signifikan pada tumbuhan yang telah diberi mikroorganisme penambat nitrogen tertentu, misalnya bakteri Rhizobia dan beberapa bakteri endofit penambat nitrogen. Cara mengukur aktivitas nitrogenase atau laju penambatan nitrogen oleh suatu mikroorganisme adalah sebagai berikut:

Estimasi Aktivitas Fiksasi Nitrogen Biologis  (Aktivitas Enzim Nitrogenase)

Metode Analisis Kuantitatif Amonia Kjeldahl

Metode Kjedahl merupakan metode yang umum digunakan pada periode 1800an untuk mengukur kadar nitrogen pada suatu bahan organik yakni amonia dengan asumsi, makin banyak amonia yang terdeteksi maka makin tinggi pula aktivitas nitrogenase/fiksasi nitrogen oleh suatu mikroorganisme atau organ tumbuhan tertentu.

Prinsip kerja metode ini adalah dengan mengukur amonia yang dilepas oleh suatu sampel setelah sampel tersebut direaksikan dengan asam sulfat dan katalis yang akan memecah asam-asam amino yang dikandung sampel. Pemecahan asam amino oleh asam sulfat tersebut berupa gas amonia yang diperangkap dengan perangkat destilasi, dalam bentuk NH4+ yang terlarut dalam air. Selanjutnya, amonia yang telah larut tersebut dikuantifikasi dengan metode titrasi.

Gambar 1 Perangkat uji amonia Kjedahl: sampel didigesti dalam tabung erlenmeyer berisi asam sulfat dan katalis. Campuran tersebut dipanaskan hingga asam-asam amino dan senyawa nitrogen lain melepaskan amonia yang akan diembunkan dalam kondensor dan ditampung pada sebuah wadah. Amonia yang dihasilkan diukur dengan metode titrasi (sumber gambar: www.brooklyn.cuny.edu)

 Metode Analisis Reduksi Asetilen

Nitrogenase juga memiliki kemampuan mereduksi gas asetilen (C2H2) menjadi gas etilen selain kemampuannya mereduksi gas nitrogen (N2) menjadi gas amonia (NH3). Metode ini banyak digunakan karena memiliki sensitivitas yang tinggi terhadap aktivitas fiksasi nitrogen secara biologis. Metode ini dapat diaplikasikan untuk mengukur aktivitas fiksasi nitrogen dalam laboratorium maupun di lapangan, dengan menggunakan nodul akar, bagian akar, atau seluruh bagian dari tumbuhan yang diinginkan.

Gambar 2 Reaksi reduksi asetilen menjadi etilen oleh nitrogenase

Metode ini dinyatakan sebagai metode yang digunakan untuk mengukur fluktuasi elektron pada kompleks enzim nitrogenase, serta alokasi elektron yang digunakan untuk memfiksasi nitrogen dan mereduksi proton (H+) menjadi H2, karena gas asetilen memiliki jumlah ikatan kovalen yang sama dengan gas nitrogen, yakni sama-sama memiliki tiga ikatan kovalen (Gambar 2).

Gambar 3 konfigurasi ikatan kovalen pada gas nitrogen dan asetilen. Keduanya sama-sama memiliki ikatan kovalen berjumlah tiga (triple bonds)

Kelemahan dari metode ini adalah jumlah etilen yang terbentuk tidak berkorelasi langsung dengan jumlah nitrogen yang terfiksasi.  Kelemahan lain dari metode ini adalah pada saat aplikasikan untuk mengukur aktivitas aktivitas nitrogenase di lapangan, terutama tanaman polong-polongan seperti kedelai yang memiliki sistem perakaran panjang akan menyulitkan pengukuran secara total, karena banyaknya nodul yang terlepas dari perakaran saat tumbuhan tersebut diambil untuk diukur aktivitas fiksasi nitrogennya.

Metode ini dilakukan dengan meletakkan nodul-nodul akar dengan atau tanpa sistem perakaran penyangganya atau seluruh bagian tumbuhan uji secara utuh pada wadah tertutup yang kedap udara. Sebagian udara pada wadah tersebut dikeluarkan, dan diganti gas asetilen dengan volume yang sama dengan jumlah udara yang dikeluarkan. Umumnya, gas asetilen yang digunakan berjumlah 10% dari udara total pada wadah tersebut. Jumlah gas asetilen yang direduksi oleh nitrogenase diukur dengan mencuplik sejumlah udara dari perangkat uji dan mengukur gas etilen yang terbentuk dengan kromatografi gas.

Gambar 4 Prosedur pengukuran fiksasi nitrogen biologis dengan metode analisis reduksi asetilen pada sistem perakaran bernodul

Pengukuran Jumlah Nitrogen Terfiksasi Dengan Metode Pengukuran Isotop 15N

Pengukuran radioisotop nitrogen (15N) dapat digunakan untuk mengetahui aktivitas fiksasi nitrogen. Dasar dari pengukuran ini adalah meningkatnya jumlah isotop 15N pada tumbuhan dibanding jumlah normal. Langkah dari prosedur ini adalah menambahkan isotop N-16 pada medium tanam atau pada udara dan mengukur keberadaan isotop nitrogen tersebut pada sampel dengan menggunakan metode spektroskopi massa (Burris dan Wilson, 1945).

Pengukuran Jumlah Hidrogen

Produksi hidrogen dari reduksi proton (H+) merupakan salah satu reaksi yang pasti terjadi pada proses reduksi nitrogen oleh kompleks nitrogenase (Witty dan Minchin 1998). Oleh karena itu, pengukuran jumlah hidrogen dapat digunakan untuk mengukur aktivitas nitrogenase. Kelebihan dari metode ini adalah jumlah hidrogen yang terukur dapat berkolerasi langsung jengan jumlah nitrogen yang terfiksasi, serta lebih aman dibandingkan menggunakan gas asetilen yang mudah terbakar (Hunt, 1993). Metode ini juga memungkinkan pengukuran aktivitas nitrogenase secara realtime karena menggunakan alat ukur yang dapat dibaca dengan program logger pada komputer. Program tersebut akan langsung menghitung jumlah nitrogen yang terfiksasi berdasarkan jumlah gas hidrogen yang dihasilkan oleh nodul akar.

Metode ini dilakukan dengan menggunakan perangkat open-flow gas exchange yang tidak membutuhkan wadah tertutup (Gambar 5). Gas hidrogen yang dihasilkan oleh nodul akar dikumpulkan dalam gas restrictor dan dipompakan kedalam desikator sebelum diukur dengan perangkat oxygen detector untuk mengukur jumlah oksigen. Selanjutnya jumlah hidrogen diukur pada perangkat detektor hidrogen. Hasil pembacaan tersebut akan diolah dengan program komputer yang terhubung dengan perangkat tersebut.

 

Gambar 5 Perangkat deteksi hidrogen untuk mengukur aktivita nitrogenase

Pengukuran Senyawa Nitrogen Terlarut Dalam Cairan Xilem

Nitrogen yang difiksasi oleh mikroorganisme pemfiksasi nitrogen pada nodul akar atau organ tumbuhan lain umumnya akan ditransfer dengan jaringan pembuluh angkut xilem dalam bentuk ureida, alantoin, asam alantoat, dan asam amino seperti glutamin dan asparagin Kushizaki et al. (1964). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Ohyama dan Kumazawa (1979) dengan membandingkan jumlah 15N2 yang difiksasi dalam nodul akar dengan kandungan 15NO3- , ureida-lah senyawa nitrogen terlarut cairan xilem yang paling dominan pada batang tumbuhan, hingga dapat digunakan untuk mengukur aktivitas fiksasi nitrogen secara biologis.

Metode tidak perlu melakukan pencabutan tanaman uji karena dapat langsung dilakukan dengan mencuplik cairan xilem, tanpa merusak keseluruhan tanaman uji serta tidak memerlukan biaya yang mahal. Cairan xilem dapat dikumpulkan dengan melukai percabangan tanaman uji dan menampung cairan xilem dengan bantuan pipet mikro. Cairan xilem yang ditampung dapat dianalisis dengan kromatografi untuk mengetahui jumlah ureida yang terkandung dalam cairan tersebut.

Metode Pengukuran Nitrogen Total Dengan NIR-Spectroscopy

Metode Pengukuran Nitrogen Total Dengan NIR-Spectroscopy dilakukan dengan dasar kemampuan ikatan antara atom N dan atom H pada senyawa biomolekul menyerap energi elektromagnetik dengan panjang gelombang 780–2,500 nm (panjang gelombang ini sering disebur near infra red atau NIR). Asumsinya, makin tinggi jumlah absorbansi yang diperoleh dari analisis sampel, maka makin tinggi pula jumlah nitrogen yang difiksasi dalam tumbuhan tersebut. Metode ini sering dikalibrasi dengan metode Kjedahl karena perubahan kandungan air pada sampel akan mempengaruhi pembacaan dari NIR-spectrometer.

Kelebihan utama dari metode ini adalah tidak dekstruktif dan dapat menghasilkan data dengan pembacaan maksimal meski sampel yang digunakan sangat sedikit. Kelemahannya adalah pembacaan yang dapat terganggu oleh material sampel yang tidak dihaluskan dengan baik serta sensitif terhadap perubahan kandungan air pada sampel tersebut. Jumlah sampel yang terlalu banyak juga akan menimbulkan bias karena gelombang elektromagnetik yang tidak mampu menembus campuran dengan turbiditas besar.

 

Daftar Pustaka

Hunt, S. and Layzell, D.B. 1993. Gas exchange of legume nodules and the regulation of nitrogenase activity. Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology, 44:483-511.

Witty, J.F. and Minchin, F.R., 1998 Methods for the continuous measurement of O2 consumption and H2 production by nodulated legume root systems, J. Exp. Bot., 49, 1041-1047

Burris, H, and W Wilson. 1945. “H. Burris and.” Exchange Organizational Behavior Teaching Journal, no. 3.

author
Author: 
Laila Karomah yang lebih sering berpetualang di dunia maya sebagai evilgenius, merupakan mahasiswi Mikrobiologi Institut Pertanian Bogor. Bidang yang digemari oleh pegiat IT otodidak ini adalah mikrobiologi kesehatan, mikrobiologi lingkungan, bioteknologi mikrob, dan enzimologi.

Leave a reply "Estimasi Aktivitas Penambatan Nitrogen Biologis (Aktivitas Enzim Nitrogenase)"

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.